Fonte: ACS Publications

Abstrato

Os fertilizantes químicos têm sido cruciais para sustentar a actual população global, complementando as terras agrícolas excessivamente utilizadas para apoiar a produção consistente de alimentos, mas a sua utilização é insustentável. Pseudomonas chlororaphis é uma bactéria fixadora de nitrogênio que poderia ser usada como substituto de fertilizante, mas esse micróbio é delicado. É sensível a fatores estressantes, como liofilização e altas temperaturas. Aqui, demonstramos a proteção de P. chlororaphis contra liofilização, altas temperaturas (50 o C) e alta umidade usando revestimentos de rede metal-fenólica de automontagem (MPN). Descobriu-se que a composição do MPN tem um impacto significativo na sua eficácia protetora e, com composições otimizadas, não se observa perda de viabilidade para micróbios revestidos com MPN sob condições em que as células não revestidas não sobrevivem. Além disso, demonstramos que os micróbios revestidos com MPN melhoram a germinação das sementes em 150% em comparação com aquelas tratadas com P. chlororaphis fresco. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram as capacidades protetoras dos MPNs contra estressores ambientais e representam um passo crítico para permitir a produção e armazenamento de micróbios delicados sob condições não ideais.

Introdução

Os fertilizantes químicos têm sido essenciais para alimentar a população global actual, complementando as terras agrícolas sobreutilizadas para apoiar a produção alimentar consistente. Mas estes produtos químicos são insustentáveis;(1,2)eles danificam o meio ambiente,(3,4)e contribuem para as emissões de gases com efeito de estufa.(5,6)Além disso, o escoamento agrícola contendo fertilizantes químicos pode entrar nas águas superficiais e subterrâneas(7,8)e danificar ecossistemas nativos.(9,10)Além das preocupações ambientais, os fertilizantes químicos são caros, representando entre 20% e 36% do orçamento operacional de uma exploração agrícola.(11)Nos últimos dois anos, os preços dos fertilizantes químicos quase triplicaram, passando de 94 dólares para 232 dólares por acre de milho.(12,13)Este custo tem impacto nos preços dos alimentos ao consumidor e pode levar à diminuição dos rendimentos devido à aplicação insuficiente de fertilizantes.(11)Estes impactos ambientais e económicos exigem soluções agrícolas alternativas; a terra para a agricultura é um recurso finito e a sua utilização sustentável a longo prazo é essencial para a estabilidade alimentar.

Os micróbios oferecem alternativas sustentáveis ​​aos fertilizantes químicos, especialmente devido ao seu papel nativo no crescimento das plantas.(14-16)Os micróbios podem processar eficientemente nutrientes essenciais ( ou seja, , nitrogênio, fósforo e enxofre) para torná-los biodisponíveis para as plantas, eles podem manipular a sinalização dos hormônios vegetais,(17)e podem impedir patógenos invasivos.(18)Devido à sua importância, os investigadores têm trabalhado para entregar micróbios ao solo, mas as espécies críticas são difíceis de produzir e transportar devido à sua sensibilidade à temperatura.(19)e umidade.(20)Consequentemente, uma plataforma para estabilizar micróbios delicados contra factores de stress durante o processamento, armazenamento e transporte permitiria uma adopção agrícola generalizada.

Recentemente relatamos revestimentos de rede metal-fenólica (MPN) que servem como revestimentos de esporos sintéticos,(21-23)protegendo micróbios do processo de secagem e anaeróbios da exposição ao oxigênio. Os MPNs são compostos de polifenóis e íons metálicos que se agrupam em redes bidimensionais.(24-27)Diversos polifenóis e íons metálicos têm sido usados ​​para montar esses materiais, e as identidades dos componentes têm sido ligadas às propriedades físicas da rede final montada. É importante ressaltar que para aplicações agrícolas, os componentes desses materiais são geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA.

Aqui, estabelecemos a capacidade desses materiais de proteger a bactéria fixadora de nitrogênio, Pseudomonas chlororaphis, importante para a agricultura. .(28) P. clororaphis interage nativamente com as raízes das plantas e fixa nitrogênio nelas.(29-31)Também pode proteger as plantas contra fungos e pragas fitopatogênicas.(32,33)No entanto, P. clororaphis é altamente instável a temperaturas elevadas e os esforços anteriores para proteger esta espécie falharam.(34)Demonstramos a proteção de P. chlororaphis com MPNs. É importante ressaltar que descobrimos que a composição do MPN desempenha um papel crítico na eficácia protetora, com base tanto na valência do metal quanto no tamanho e número de locais de quelação no polifenol. Ao determinar a composição ideal de MPN para proteção de P. chlororaphis, as composições ideais demonstraram permitir que esses micróbios sobrevivessem à exposição ambiental adversa, incluindo liofilização, armazenamento em temperaturas tão altas quanto 50 °C e umidade de 48% (umidade relativa). Demonstramos ainda que nosso P. chlororaphis formulado é mais benéfico para a germinação de sementes do que até mesmo micróbios frescos. Juntos, estes resultados estabelecem que a composição do MPN impacta diretamente o comportamento protetor.

Resultados e discussão

Mostramos que os MPNs se formam prontamente em diversos micróbios procarióticos, incluindo Bacillus subtilis e Bacteroides thetaiotaomicron .(21-23) P. chlororaphis é uma espécie fixadora de nitrogênio encontrada nativamente em ecossistemas de solo e tem sido utilizada como bioinoculante na agricultura devido às suas propriedades benéficas, tornando-se um importante alvo de proteção. Além disso, P. chlororaphis é especialmente útil para estudar a eficácia protetora do MPN devido à sua conhecida instabilidade de temperatura. Em trabalhos anteriores, mostramos que os MPNs podem melhorar significativamente a proteção de bioterapêuticos e probióticos vivos para permitir a sua entrega.(21-23)Aqui, descobrimos que os componentes do MPN impactam significativamente sua eficácia protetora contra liofilização, altas temperaturas e alta umidade.

Formação de MPN em P. chlororaphis e proteção contra liofilização

MPNs são complexos de coordenação de dimensões superiores de íons metálicos e polifenóis que se formam por meio da automontagem. Embora uma gama diversificada de polifenóis e íons metálicos possa ser usada para a formação de MPN, nos concentramos em três polifenóis bem estudados que são GRAS aprovados pelo FDA (Figura 1 a ) . Esses três polifenóis, ácido tânico (TA), galato de epigalocatequina (EGCG) e ácido gálico (GA), abrangem toda a faixa de diâmetros moleculares e número de locais de quelação, sendo TA o maior com mais catecóis e GA o menor com o menor número de grupos de catecol. Na presença de um cátion di ou trivalente, os polifenóis quelam e geram uma rede de coordenação estendida. Em geral, observamos montagens estruturalmente mais rígidas com cátions trivalentes e queremos nos concentrar em metais que sejam benéficos e tenham baixo risco de citotoxicidade.(25,35-37)Portanto, focamos em Fe 3+ , Mn 3+ , Al 3+ e Zn 2+ como componentes metálicos do MPN. Após a transição da solução de formação de MPN para um pH acima de 8,0, os íons metálicos quelam os grupos fenólicos dos polifenóis, formando centros de coordenação bem definidos.

Figura 1. Montagem de rede metal-fenólica (MPN) em P. chlororaphis e suas imagens de fluorescência. (a) As células foram revestidas com uma mistura de polifenóis (TA, EGCG e GA) e íons metálicos (Fe e Mn). (b) As células foram tratadas com um kit de coloração de mortos-vivos. São mostradas imagens de fluorescência de P. chlororaphis não revestido e revestido com Fe III -TA no canal FITC (SYTO-9) e canal TxRed (iodeto de propídio) e como imagens mescladas. As barras de escala são 20 μm. As viabilidades de P. chlororaphis foram de 98,3% (não revestido), 98,4% (revestido com Fe III -TA) e 79,6% (revestido com Fe III -TA mas sem adição de MOPS).

Através da espectroscopia UV-vis, estabelecemos prontamente a formação de MPNs em P. chlororaphis através do aparecimento de uma banda bem definida de transferência de carga ligante-metal (LMCT) após desprotonação total e coordenação da rede. Demonstramos anteriormente que o aparecimento desta banda LMCT corresponde à formação de revestimentos núcleo-invólucro contíguos em substratos microbianos ( Figura 2 b).(22)Além da verificação UV-vis da formação de MPN, visualizamos células usando um complexo fluoróforo-BSA que interage especificamente com MPNs (e não com células não revestidas, Figuras S1, S2 ). Confirmamos através destas imagens que os MPNs formam um revestimento contíguo nos micróbios que não está presente nas células não revestidas. A fluorescência consistente em toda a superfície das células revestidas confirma que estruturas uniformes de núcleo-invólucro são formadas nesses micróbios, como aconteceu conosco em relatórios anteriores.(21-23)Além disso, tal como acontece com outras estirpes que avaliamos, a viabilidade de P. chlororaphis revestido com MPN (98,4%) é comparável à dos controlos não revestidos (98,3%) imediatamente após o revestimento. Isto foi avaliado por coloração viva e morta com microscopia de fluorescência ( Figura 1 b). Descobrimos também que a adição de um tampão MOPS foi crítica para manter a viabilidade de P. chlororaphis revestido com MPN . Em contraste, descobriu-se que MPNs fracamente formados e pH baixo afetam negativamente a viabilidade celular.(21-23)Ambos os resultados são críticos, pois os componentes dos MPNs por si só estão associados à toxicidade, o que observamos quando não são definidos usando um tampão de pH alto. Assim, demonstramos que é necessário definir o revestimento MPN com um tampão MOPS básico para observar os efeitos protetores do MPN.

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