Introdução

Os determinantes genéticos da qualidade nutricional têm sido estudados há muito tempo em muitas culturas importantes 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . No entanto, os mecanismos que ligam os poucos determinantes genéticos identificados aos fenótipos finais são em grande parte desconhecidos. Isto é verdade para os tococromanóis, um grupo de compostos produzidos exclusivamente em organismos fotossintéticos 6 , 7 e que inclui tocoferóis e tocotrienóis (denominados vitamina E-VTE-), que possuem alto valor nutricional na dieta humana. Os tocoferóis são as moléculas que apresentam maior atividade de TEV 8 . Esses compostos consistem em um grupo de cabeça polar de cromanol (derivado do homogentisato) e uma cadeia lateral prenil lipofílica, produtos das vias do chiquimato plastidial e do metileritritol fosfato, respectivamente. A primeira etapa para a síntese de tocoferol é catalisada pela homogentisado fitil transferase (VTE2, EC 2.5. 1.-), que condensa o fitil 2P e o homogentizado para produzir 2-metil-6-fitilquinol. A partir deste precursor, são sintetizadas as quatro formas que ocorrem naturalmente. Enquanto γ- e α-tocoferol são produzidos pelas atividades sequenciais de dimetil-fitilquinol metil transferase (VTE3, EC 2.1.1.-), tocoferol ciclase (VTE1, EC 5.3.-.-) e tocoferol C-metil transferase (VTE4 , CE 2.1.1.95); A síntese de δ e β-tocoferol não requer que a atividade VTE3 seja formada meramente pela ação das duas últimas enzimas ( Fig. 1a ) 9 . O papel dos tocoferóis como antioxidantes lipossolúveis está bem documentado para plantas e humanos e ocorre por dois mecanismos: (i) doação de um átomo de hidrogênio a um radical peroxil de ácido graxo poliinsaturado altamente reativo, evitando assim uma reação em cadeia de peroxidação lipídica e (ii ) extinguindo física ou quimicamente espécies de oxigênio singlete, que danificam muitas moléculas biológicas, incluindo proteínas, DNA, carboidratos e ácidos graxos poliinsaturados 10 . Dado que a fotossíntese é uma importante fonte de oxigênio singleto, este mecanismo de extinção desempenha um papel importante na regulação funcional do fotossistema II, com implicações importantes nas respostas fisiológicas a condições de alta luminosidade, baixa temperatura e estresse osmótico 11 .

( a ) A via central do tocoferol nas plantas. Enzimas biossintéticas, homogentisado fitil transferase (VTE2), dimetil-fitilquinol metil transferase (VTE3), tocoferol ciclase (VTE1) e γ-tocoferol C-metil transferase (VTE4) estão em tipos azuis. Precursores e intermediários são: homogentisato (HGA), fitil 2P (PDP), metil-fitilquinol (MPBQ) e dimetil-fitilquinol (DMPBQ). ( b ) Composição e teor de tocoferol total (média ± SEM, n = 4) em frutos maduros de tomate das duas espécies parentais; S. lycopersicum (cv. M82) e S. pennellii (LA716), e a IL9-2-6 que mostra o QTL mapeado. ( c ) Mapeamento fino do QTL 9-2-6 para uma região centromérica do cromossomo 9 que abriga o alelo selvagem do gene VTE3 (1). Através da análise de 190 plantas F2 e 50 plantas F3, derivadas do cruzamento entre S. lycopersicum (cv. M82) e IL9-2-6, foi obtida uma sub-linhagem recombinante (IL9-2-6-1). O conteúdo de tocoferol (média ± SEM, n = 6) em frutos maduros de tomate destas linhas é mostrado no lado direito deste painel. A estrutura genômica da introgressão contida nesta linha é mostrada abaixo com setas pretas indicando genes transcricionalmente ativos. Uma visão ampliada dos alelos de S. lycopersicum e S. pennellii do gene VTE3 (1) mostra polimorfismos e inserções sinônimos (barras azuis) e não sinônimos (barra vermelha) no segundo íntron e na 3′UTR. As caixas pretas e cinza representam exons e 5′ e 3′ UTR, respectivamente. ( d ) Estrutura proteica da enzima VTE3 (1) do tomate indicando a substituição de aminoácidos (S37P). ( e ) A expressão transitória de ambos os alelos da proteína de fusão VTE3(1)::GFP em células mesofílicas de folhas de N. benthamiana indica direcionamento ao cloroplasto sob exame de microscopia confocal. Os asteriscos nos painéis b e c denotam diferenças estatisticamente significativas para o tocoferol total (T) e as formas de tocoferol indicadas ( teste t P< 0,05). O esquema do cromossomo 9 é baseado em distâncias físicas calculadas de acordo com a versão SL2.4 do genoma do tomate ( www.solgenomics.net ). A barra branca em e indica 25 μm.

A importância do tocoferol tanto para os organismos produtores quanto para os consumidores levou à pesquisa de loci de características quantitativas (QTL) que determinam o conteúdo de TEV 3 , 12 , 13 , 14 , 15 . No tomate, revelamos a existência de quatro QTL metabólicos (mQTL) que afetam os níveis totais de tocoferol nos frutos 9 . Estes quatro mQTL são mapeados nos cromossomos 6, 8 e 9. No entanto, dada a herdabilidade muito baixa (H 2 ) do conteúdo de TEV no tomate 16 , será difícil produzir frutos com teores elevados de TEV até que os determinantes genéticos e mecanismos subjacentes a esses QTL sejam totalmente compreendido.

Neste trabalho, relatamos o mapeamento fino do principal mQTL de TEV (mQTL 9-2-6 ) em tomate para um locus que codifica uma enzima VTE3. Mostramos que os alelos VTE3 (1) são expressos diferencialmente e que essas diferenças se correlacionam com diferenças na metilação do DNA das sequências promotoras e no acúmulo de RNA interferente curto (siRNAs) correspondentes. Consistente com o mQTL 9-2-6 sendo de natureza epigenética, descobrimos que a metilação do DNA no VTE3(1) varia consideravelmente entre as populações naturais de tomate e que o VTE3(1) pode reverter espontaneamente da forma metilada para a não metilada, com impacto no TEV conteúdo em frutas.

Resultados

Mapeamento fino de um importante tocoferol mQTL em frutos de tomate

Decidimos identificar o (s) gene (s) causal (is) abrigado (s) pelo mQTL específico da fruta para o conteúdo total e α-tocoferol que havia sido previamente mapeado no cromossomo 9 (mQTL 9-2-6 ) 9 ( Fig. 1b e Fig. Complementar .1a ). Para tanto, foi realizado mapeamento fino utilizando uma população F2 de 190 indivíduos, derivada de um cruzamento entre a linhagem parental S. lycopersicum (cv. M82) e a linhagem introgressiva 9-2-6 (IL9-2-6) ( abrangendo aproximadamente 3 Mb e contendo mais de aproximadamente 300 genes). Os marcadores moleculares C2_At3g63190 (58,9 Mb), VTE3(1)INDEL (59,6 Mb), C2_At4g02580 (60 Mb), 1531800 (61,0 Mb) e C2_At2g47890 (61,8 Mb) (Figura 1b suplementar) foram utilizados para triagem e o fragmento introgredido segregado 2:1:1 ( S.lyc / S.pen : S.lyc / S.lyc : S.pen / S.pen , χ2 = 0,98). Uma única linha recombinante entre os marcadores C2_At4g02580 e 1531800 foi identificada e autofecundada para dar origem à IL9-6-2-1 recombinante, que abriga apenas 769 Kb do fragmento introgresso original. A quantificação de TEV demonstrou que o mQTL de tocoferol total foi mantido nesta IL recombinante ( Fig. 1c ). Dos 56 supostos quadros de leitura abertos (ORFs) presentes neste intervalo de 789 Kb ( www.solgenomics.net ), 13 ORFs não são suportados por nenhum dado de expressão disponível (tags de sequência expressa ou leituras de RNA-seq) e apenas 36 mostram níveis de expressão detectáveis ​​em frutos de tomate. Uma análise de anotação funcional do MapMan 17 revelou que destes 36, apenas um único gene ( locus VTE3 (1) -Solyc09g065730-), pertence à categoria Metabolismo Secundário ( Tabela Suplementar 1 ). Este gene apresentou alta similaridade (~ 85%) com uma dimetil-fitilquinol metil transferase de Arabidopsis (EC 2.1.1.-; Figura Complementar 1c, d ) que catalisa a conversão de 2-metil-6-fitilquinol em 2,3 -dimetil-5-fitilquinol, o precursor imediato do γ-tocoferol ( Fig. 1a ) 18 . Este gene está duplicado em várias espécies de eudicotiledôneas, incluindo S. lycopersicum ( Figura 1c Complementar ). O VTE3(1) do tomate possui 339 aminoácidos e contém os dois domínios funcionais característicos encontrados na proteína Arabidopsis , bem como um suposto peptídeo de trânsito do cloroplasto. Ao comparar a divergência alélica entre S. lycopersicum e S. pennelliiproteínas, foi encontrado um único polimorfismo de aminoácido localizado dentro de uma região pouco conservada do peptídeo de trânsito do cloroplasto ( Fig. 1d e Fig. Complementar 1d ). Ensaios de localização subcelular transitória realizados com alelos de S. lycopersicum e S. pennellii fundidos com GFP indicaram que ambos os alelos VTE3 (1) são direcionados para o cloroplasto onde ocorre a biossíntese de tocoferol ( Fig. 1e ). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o TEV3 (1) é um dos principais determinantes do mQTL 9-2-6-1 para o conteúdo de tocoferol da fruta, mas é improvável que o(s) polimorfismo(s) causal(is) resida(m) na sequência de codificação.

Os níveis de mRNA de VTE3 (1) modulam o conteúdo de VTE em frutos de tomate

A fim de demonstrar o envolvimento do VTE3 (1) na determinação do teor de tocoferol nas frutas, silenciamos especificamente esse gene nas frutas por meio de um protocolo estabelecido de silenciamento gênico induzido por vírus, que se baseia na fluorescência da GFP como marcador visual 19 . Para este propósito, um fragmento de 380 pb da região codificadora de GFP foi fundido a um fragmento de 349 pb do gene de tomate VTE3 (1) para co-silenciamento. Após a infiltração dos pedúnculos inflorescentes, os setores silenciados por GFP dos frutos foram monitorados na planta ao longo do desenvolvimento e os tomates verdes maduros (MG) e maduros foram colhidos 42 e 60 dias após a infiltração, respectivamente. Os setores sem fluorescência foram dissecados ( Fig. 2a ) e os níveis de mRNA de VTE3 (1) foram medidos por PCR quantitativo (qPCR). Reduções de aproximadamente 60% foram observadas nos setores de pericarpo silenciados por GFP em relação aos frutos formados a partir de plantas infiltradas apenas com pTRV2-GFP ( Fig. 2b ). Em seguida, testamos o efeito do silenciamento do VTE3 (1) no metabolismo do tocoferol nas frutas. As formas de tocoferol dependentes de TEV3 (γ e α) apresentaram reduções significativas em ambos os estágios de desenvolvimento, enquanto as formas independentes de TEV3 (δ e β) aumentaram mais de duas vezes. Além disso, os níveis absolutos de α- e γ-tocoferol foram significativamente reduzidos em frutos maduros silenciados por VTE3 (1) ( Fig. 2c ). Estas alterações no metabolismo do tocoferol foram especificamente relacionadas ao silenciamento de VTE3 (1), uma vez que os níveis de mRNA dos outros genes da via biossintética do núcleo do tocoferol ( VTE1 , VTE3 (2) e VTE4 ) permaneceram inalterados neste experimento ( Figura 2a Complementar ). Além disso, uma análise do perfil metabólico dos tecidos silenciados não revelou alterações importantes, sugerindo que esta enzima não afeta o metabolismo primário. No entanto, aumentos de licopeno e α-caroteno foram detectados em frutos maduros nos quais o gene VTE3 (1) foi silenciado ( Figura 2b Complementar ) e essas alterações foram acompanhadas por um aumento da capacidade antioxidante ( Figura 2c Complementar ). Estes dados demonstram assim que a alteração dos níveis de ARNm de VTE3 (1) afecta directamente o conteúdo e a composição do tocoferol no tomate e, além disso, apoia hipóteses anteriores de que o estado redox do fruto é equilibrado por mecanismos que afectam as vias metabólicas associadas ao metabolismo do tocoferol e dos carotenóides 20 , 21 , 22 .

( a ) GFP (controle) e GFP – VTE3 (1) MG silenciado e frutos maduros colhidos de pedúnculos inflorescentes agroinfiltrados com silenciamento de genes induzidos por vírus de tomateiros que expressam GFP ( S. lycopersicum cv. Moneymaker). ( b ) Níveis relativos de mRNA de VTE3 (1) em GFP (controle) e GFP – VTE3 (1) frutos silenciados (média ± sem, n = 6). ( c ) Conteúdo de tocoferol (μg g −1 FW ± sem, n = 6), composição relativa de tocoferol e proporção de formas de tocoferol dependentes de VTE3 e independentes de VTE3 das mesmas frutas silenciadas mostradas em a são indicadas por números, gráficos de pizza e semicírculos, respectivamente. Observe que os tamanhos dos gráficos de pizza são proporcionais ao conteúdo médio total de tocoferol. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas ( teste t P< 0,05).

A expressão específica dos alelos VTE3 (1) determina mQTL 9-2-6

Tendo demonstrado que a expressão de VTE3 (1) determina os níveis de tocoferol tanto no MG quanto nos estágios maduros, em seguida comparamos a expressão dos alelos cultivados e selvagens. De acordo com os perfis de conteúdo de tocoferol ( Fig. 1b ), o alelo selvagem apresentou níveis de mRNA significativamente mais elevados em frutos maduros de ambas as linhas de introgressão (IL9-2-6 e 9-2-6-1) em comparação com o controle parental receptor . Em outras palavras, QTL 9-2-6 é uma expressão QTL (eQTL; Fig. 3a ). O maior acúmulo de mRNA de VTE3 (1) após a introgressão do alelo selvagem no fundo de S. lycopersicum não foi restrito aos frutos maduros, mas também foi observado nas folhas e no desenvolvimento dos frutos ( Fig. 3b ). Além disso, estas diferenças na expressão de VTE3 (1) não são acompanhadas por alterações no nível de expressão de qualquer um dos outros genes que codificam as enzimas envolvidas na via biossintética do tocoferol ( Fig. 3c ). Além disso, a avaliação dos níveis de expressão de outras 19 ORFs presentes no segmento IL9-2-6-1 introgredido por qPCR mostrou resultados semelhantes aos depositados em bases de dados públicas (ted.bti.cornell.edu), exceto para três ORFs. No entanto, nenhuma destas três ORFs está relacionada com as vias metabólicas do TEV e a sua expressão não se correlaciona com os níveis de tocoferol no tomate. Além disso, os três ortólogos de A. thaliana não são coexpressos com nenhum gene envolvido na biossíntese de tocoferol 23 . Tomados em conjunto, estes resultados confirmam ainda que o VTE3(1) é o gene causal albergado pelo mQTL 9-2-6.

a ) Níveis de mRNA de VTE3 (1) em frutos maduros das linhagens parentais S. lycopersicum (cv. M82) e IL9-2-6 e a IL9-2-6-1 recombinante resultante (média ± sem, n = 5) . ( b ) Níveis de mRNA de VTE3 (1) nas folhas fonte (Sr L) e sumidouro (Sn L) e ao longo do desenvolvimento dos frutos (frutos verdes-G, verdes-MG maduros, breaker-Br e maduros-R) colhidos das linhagens parentais S. lycopersicum (cv. M82) e IL9-2-6 (média ± sem, n = 6). ( c ) níveis de mRNA quantificados em frutos maduros das linhagens parentais S. lycopersicum (cv. M82) e IL9-2-6 de todos os genes que codificam enzimas envolvidas no metabolismo do tocoferol do tomate de acordo com 24 (média ± sem, n = 3). Os genes pertencentes ao núcleo do tocoferol, associados às vias do metileritritol fosfato e do chiquimato são indicados em azul, preto, vermelho e verde, respectivamente. ( d , e ) mRNA de VTE3 (1), composição de tocoferol e níveis totais medidos em linhagens homozigóticas e heterozigóticas de VTE3 (1) para duas gerações (F1 e F2) derivadas de um cruzamento entre S. lycopersicum (cv. M82) e IL9- 2-6 (média ± sem, n =5). A contribuição de cada alelo VTE3 (1) ( S. lycopersicum e S. pennellii ) foi quantificada por PCR-transcriptase reversa quantitativa específica do alelo e indicada por barras cinza claro e escuro, respectivamente. Os asteriscos em a , b , c e d denotam diferenças estatisticamente significativas (teste de randomização P < 0,05 corrigido pela taxa de descoberta falsa em caso de testes múltiplos). Os asteriscos em e denotam diferenças estatisticamente significativas para o tocoferol total (T) e as formas de tocoferol indicadas ( teste t P< 0,05).

Para desvendar ainda mais a natureza do eQTL VTE3 (1), sua estabilidade transgeracional foi analisada em frutos maduros das linhagens híbridas F1 e segregantes F2 com as três possíveis combinações de alelos determinadas por um ensaio de expressão específico de alelo. No híbrido F1, o nível total de mRNA de VTE3 (1) é equivalente ao medido em IL9-2-6 como consequência da dominância do alelo selvagem. Da mesma forma, a expressão de VTE3 (1) apresenta o mesmo padrão nas linhas recombinantes F2 derivadas ( Fig. 3d ). Além disso, o conteúdo total de tocoferol segue o mesmo perfil dos níveis de mRNA de VTE3 (1) ( Fig. 3e ), sugerindo que o mQTL 9-2-6 e o ​​eQTL de VTE3 (1) estão firmemente e estavelmente acoplados ao longo das gerações.

Revelando o mecanismo molecular do tocoferol QTL 9-2-6

Os níveis mais elevados de mRNA de VTE3 (1) em IL9-2-6 e IL9-2-6-1 podem ser o resultado de diferenças nas atividades do promotor transcricional entre os alelos domesticados e selvagens. Portanto, analisamos as regiões promotoras desses alelos por meio de uma busca de novo por elementos reguladores cis (CREs) 24 . O promotor do gene VTE3 (1) de S. lycopersicum contém sete CREs estatisticamente super-representados, enquanto o de S. pennelli contém quatro. Dois destes elementos são comuns às regiões promotoras VTE3 (1) de S. lycopersicum , S. pennellii e S. phureja ( Figura 3a suplementar ). Comparações adicionais entre as regiões promotoras de S. lycopersicum , S. pimpinellifolium , S. pennellii e S. phureja revelaram padrões distintos de inserções de elementos transponíveis (TE). Enquanto duas cópias da família Tc1-IS630-Pogo de transposons de DNA 25 são comuns entre todas as quatro espécies analisadas, indicando que estavam presentes no ancestral comum, um elemento retrotransposon da família SINE 26 é encontrado exclusivamente na espécie mais próxima, S. lycopersicum e S. pimpinellifolium , sugerindo uma inserção específica posterior na linhagem do tomate (seção Lycopersicon; Figura 3b suplementar ). Além disso, a região genômica que abrange este SINE é altamente metilada em frutos de S. lycopersicum (cv Ailsa Craig) ( //ted.bti.cornell.edu/epigenome/ ), principalmente em locais CHH, que é uma marca registrada do RNA metilação dirigida do DNA (RdDM) 27 . A fim de avaliar se a maquinaria RdDM pode estar envolvida no estabelecimento e manutenção da metilação do DNA nesta região, em seguida geramos perfis de siRNA-seq a partir de frutos maduros de S. lycopersicum , S. pennellii e IL9-2-6- 1. Descobrimos que um número considerável de espécies de 21-24 nt-siRNAs (sense e antisense) corresponde às sequências TE localizadas no promotor de S. lycopersicum ( Fig. 4a,b ), mas nenhuma em S. pennellii nem na IL9- 2-6-1. Por meio da digestão com enzima McrBC e PCR semiquantitativa específica de alelo, avaliamos o estado de metilação de três diferentes fragmentos do gene VTE3 (1): dois na região promotora (I e II) e um na sequência codificante (III). Os resultados revelaram que a região promotora proximal do alelo de S. lycopersicum que abriga o SINETE é hipermetilado, enquanto o selvagem, seja em seu próprio background ( S. pennellii ) ou no background M82 (IL9-2-6 e IL9-2-6-1), apresentou baixos níveis de metilação do DNA ( Fig. 4c ). Para melhor caracterizar esses epialelos, investigamos a metilação do DNA na resolução de um único nucleotídeo, utilizando tratamento com bissulfito do DNA genômico seguido de sequenciamento direcionado. Os resultados confirmaram a hipermetilação da região promotora (II) proximal de VTE3 (1) do alelo de S. lycopersicum nos três contextos genómicos ( Fig. 4d ). Como os siRNAs parecem estar envolvidos no estabelecimento do epialelo hipermetilado do TEV3 (1), testamos a existência de interações alélicas, como a paramutação 28 . Para determinar se este é o caso ou não, analisamos em seguida a metilação do DNA específico do alelo nos híbridos F1 e heterozigotos F2. Em consonância com os resultados da expressão ( Fig. 3d ), descobrimos que o status epigenético de cada alelo permanece inalterado nos híbridos, demonstrando que eles não são alvos de paramutação ( Fig. Complementar 4 ).

( a ) Gene VTE3 (1) e estrutura do promotor (janela de 4 Kb) mostrando exons (caixas pretas) e inserções de TE (caixas cinza claro). ( b ) Perfis de siRNA específicos de locus do VTE3(1) . As trilhas mostram a posição de mapeamento do siRNA único sentido (vermelho) e antisense (azul) obtido de frutos maduros de S. lycopersicum (cv. M82), S. pennellii (LA716) e IL9-2-6-1. A distribuição de comprimento dos siRNAs mapeados é representada à direita de cada trilha. siRNA de S. lycopersicum (cv. M82) e IL9-2-6-1 foram extraídos e analisados ​​de dois conjuntos de frutos colhidos de plantas independentes (indicados por i e ii), enquanto de S. pennellii (LA716) foram extraídos e analisados ​​a partir de um pool de cinco frutas. ( c ) Status de metilação do DNA avaliado por um tratamento de DNA com endonuclease sensível à metilação McrBC seguido de amplificação por PCR em duas regiões do promotor VTE3 (1) (I: distal e II: proximal), no primeiro exon do gene (III) e numa região codificadora do gene do cloroplasto Rubisco LS ( rbcL ) como controlo. O DNA foi extraído de pelo menos quatro frutos maduros dos genótipos S. lycopersicum (cv. M82), S. pennellii (LA716), IL9-2-6 e IL9-2-6-1. ( d ) Metilação de resíduos de citosina nos locais CG, CHG e CHH (linhas azul, vermelha e verde, respectivamente) testadas por sequenciamento de bissulfito da região promotora proximal (região II em c) em DNA extraído de frutos maduros de S. lycopersicum (cv. M82), S. pennellii (LA716), genótipos IL9-2-6 e IL9-2-6-1.

A fim de avaliar se a regulação dependente da metilação do alelo VTE3 (1) de S. lycopersicum é um mecanismo específico de M82 ou melhor, um mecanismo que pode ser estendido a outras origens genéticas, analisamos ainda a expressão de VTE3 (1) e DNA metilação em uma série alélica de raças locais andinas de tomate, três cultivares de referência comercial e uma espécie próxima ( S. pimpinellifolium -LA1589) e uma espécie selvagem distantemente relacionada ( S. habrochaites -LA407). Esses acessos foram coletados em diferentes localizações geográficas e testados nas mesmas condições de campo. Resultados publicados anteriormente demonstraram que eles diferem nos conteúdos de tocoferol e carotenóides 24 . Descobrimos que tanto a expressão de VTE3 (1) quanto a metilação de sua região promotora proximal variam entre os diferentes genótipos. Além disso, a abundância de mRNA de VTE3 (1) correlaciona-se inversamente com os níveis de metilação da região promotora proximal ( Fig. 5a e Fig. Complementar 5a ). Consequentemente, os cultivares com níveis mais elevados de mRNA de VTE3 (1) acumulam mais γ-tocoferol em frutos maduros ( Figura 5b Complementar ). A análise da sequência de um intervalo de 850 pb abrangendo o promotor do gene VTE3 (1) dos 13 genótipos aqui estudados revelou a presença de polimorfismos de nucleotídeo único e pequenos InDels, mas estes não se correlacionam com diferenças no nível de expressão ou metilação do DNA (Figs. Suplementares 5a e 6 ).

( a ) Níveis de mRNA de VTE3 (1) (média ± sem, n = 3) e status de metilação do DNA avaliado por um tratamento de DNA com endonuclease sensível à metilação McrBC, seguido por amplificação por PCR da região promotora proximal (analisada na Fig. 4d ) em frutos maduros de oito variedades crioulas de tomate andino ( S. lycopersicum ), três cultivares de referência comercial e as espécies silvestres S. pimpinellifolium (LA1589) e S. habrochaites (LA407). ( b ) Perfis de siRNAs específicos de locus de VTE3(1) . As trilhas mostram a posição de mapeamento de siRNA exclusivo de sentido (vermelho) e antisense (azul) de frutos maduros colhidos de S. lycopersicum (cv. M82) cultivado em casa de vegetação e de um ensaio de campo realizado em Mendoza (Argentina, 32° 50′S, 68° 52′W e 900 msnm). A distribuição de comprimento dos siRNAs mapeados é representada em uma caixa à direita de cada trilha. O gráfico de barras no painel direito mostra o número normalizado (± sem, n = 2) de siRNAs mapeados na região promotora proximal de VTE3(1) (indicado por uma linha azul abaixo do painel de trilhas). Os siRNAs foram extraídos e analisados ​​​​de dois conjuntos de frutos colhidos de plantas independentes, cada um (indicado por i e ii) ( c ) Metilação de resíduos de citosina nos locais CG, CHG e CHH (linhas azul, vermelha e verde, respectivamente) testada por bissulfito direcionado sequenciação da região promotora proximal (analisada na Fig. 4d ) a partir de ADN extraído de um conjunto das mesmas amostras que em b . O gráfico de barras no painel direito mostra a quantificação da metilação do DNA para cada contexto. ( d , e ) Composição de tocoferol e níveis de mRNA de VTE3 (1) (média ± sem, n = 3) das mesmas amostras de b e c . ( e ) Atividade transcricional de promotores de alelos selvagens e cultivados medidos por um ensaio transitório utilizando o vetor pGreenII 0800-LUC conforme descrito nos Métodos (± sem, n ≥6). O asterisco no painel b , c e e denota diferenças estatisticamente significativas ( teste t , teste de Fisher e teste de randomização, respectivamente; P < 0,05). O asterisco em d denota diferenças estatisticamente significativas para o tocoferol total (T) e as formas de tocoferol indicadas ( teste t P< 0,05).

Finalmente, descobrimos que o número de siRNAs direcionados ao elemento SINE e o status de metilação do promotor VTE3 (1) foram revertidos quando o cultivar de referência M82 (a linha parental recorrente dos ILs) foi cultivado em condições de campo ( Fig. 5b, c ). Esta conversão epialélica foi acompanhada por um aumento no nível de mRNA de VTE3 (1), bem como nos níveis de tocoferol em frutos maduros ( Fig. 5d, e ). Estes resultados fornecem, portanto, evidências conclusivas da natureza epigenética do mQTL 9-2-6 . Além disso, quando a atividade transcricional dos dois promotores desmetilados foi testada em um ensaio de expressão transitória, nenhuma diferença foi detectada ( Fig. 5f ), demonstrando que a diferença na expressão de VTE3 (1) de ambos os alelos resulta do silenciamento epigenético específico de a variante S. lycopersicum . Quando tomados em combinação, os resultados somados aqui apresentados demonstram que S. pennellii e S. lycopersicum VTE3 (1) são epialelos e sugerem fortemente que seu comportamento diferencial é determinado pela presença de inserções de TE dentro da região promotora.

Discussão

A identificação de genes que impactam na qualidade nutricional de frutas e vegetais domesticados tem sido um objetivo importante dos programas modernos de melhoramento genético. O tomate cultivado é uma das hortaliças mais consumidas no mundo e devido aos níveis relativamente elevados de tocoferol encontrados nos frutos do tomate, esta hortaliça é uma importante fonte de TEV na dieta humana 7 . Contudo, está documentado que o conteúdo de TEV é uma característica de baixa herdabilidade 16 , portanto um conhecimento mais abrangente dos fatores genéticos subjacentes a esta característica é um pré-requisito para a melhoria da qualidade nutricional. Neste trabalho, focamos em um mQTL importante para o tocoferol total, que mapeia a região introgredida da IL9-2-6 de S. pennellii e explica cerca de 50% da variação no TEV entre os genótipos parentais. Por meio de uma abordagem de mapeamento preciso, conseguimos restringir o determinante genético do mQTL 9-2-6 a uma região pericentromérica do cromossomo 9 que abriga o locus VTE3 (1). Este gene codifica uma 2-metil-6-fitilquinol metil transferase que é uma enzima central para a síntese de α-tocoferol e γ-tocoferol ( Fig. 1a ). O TEV3 foi objeto de um antigo evento de duplicação que, de acordo com a taxa de substituição calculada para o tomate 29 , estimamos ter ocorrido há 152±24 milhões de anos, após a radiação entre eudicotiledôneas e monocotiledôneas.

Comparação das regiões de codificação VTE3 (1) de S. pennellii e S. lycopersicum revelou uma única substituição não sinônima em uma região não conservada dentro do peptídeo de trânsito do cloroplasto ( Fig. 1d e Fig. Complementar 1d ), que não afeta o direcionamento de proteínas como indicado por experimentos de fusão GFP ( Fig. 1e ). Além disso, o ensaio de silenciamento transitório mediado por vírus demonstrou que a alteração dos níveis de mRNA de VTE3 (1) afeta diretamente o conteúdo e a composição de tocoferol no tomate ( Fig. 2 ) e que este efeito é provavelmente devido a um redirecionamento do fluxo de carbono do α – e γ-tocoferol ramificam-se para o ramo β- e δ-tocoferol da via ( Fig. 1a ). As reduções na atividade do VTE3(1) também provavelmente resultariam em um aumento na disponibilidade de geranilgeranil 2P, um precursor da biossíntese de carotenóides. Assim, os tecidos dos frutos silenciados para TEV3 (1) apresentaram incrementos significativos nos níveis de licopeno e α-caroteno e na capacidade antioxidante.

O alelo selvagem de VTE3 (1) apresentou níveis de mRNA significativamente mais elevados em todos os órgãos testados e estágios de desenvolvimento, indicando a existência de um eQTL ( Fig. 3a, b ). Exames adicionais de híbridos (F1 e F2) derivados de um cruzamento entre S. lycopersicum (cv. M82) e IL9-2-6 demonstraram que o alelo selvagem é dominante e estável através de gerações. Além disso, o mQTL 9-2-6 co-varia com a expressão de VTE3 (1), sugerindo que este eQTL determina os níveis de TEV ( Fig. 3d, e ). Além disso, a regulação positiva de VTE3 (1) em IL9-2-6 e IL9-2-6-1 favorece o fluxo de carbono para α-tocoferol ( Fig. 1c ), apoiando VTE3 (1) como o gene causal do mQTL 9-2- 6 . Entretanto, os níveis absolutos das demais formas de tocoferol não apresentaram diferenças significativas. Como uma segunda cópia do gene VTE3 está presente no tomate (como em outras espécies de plantas superiores, Figura 1c suplementar ) e muitos fatores (por exemplo, status de estresse oxidativo) podem afetar significativamente o conteúdo de tocoferol, os efeitos epistáticos ou pleiotrópicos não podem ser descartados e devem ser considerado para estudos posteriores.

Vários relatórios ligaram os eQTLs à variação fenotípica nas plantas 30 ; entretanto, no tomate apenas alguns foram propostos 31 , 32 , 33 . Experimentações adicionais nos permitiram descobrir que o eQTL VTE3 (1) é determinado pelo nível diferencial de metilação dos alelos selvagens e cultivados. Além disso, esta regulação epigenética diferencial está associada a um fragmento específico dentro da região reguladora do VTE3 (1) que abriga um SINE TE que está presente apenas em algumas espécies da seção Lycopersicon ( Figs. 3b e 6 suplementares ). Além disso, esta inserção de TE é predominantemente metilada em locais CHH e corresponde a um número considerável de siRNAs ( Figs. 4 e 5 ), sugerindo o envolvimento da maquinaria RdDM no estabelecimento e manutenção da metilação do DNA neste locus 27 . Consequentemente, o promotor de VTE3(1) não possui a inserção SINE e não é metilado em S. pennellii. Por outro lado, esta inserção SINE nem sempre é metilada quando presente no promotor de VTE3(1) e a conversão do estado metilado para o não metilado foi observada em alguns casos ( Fig. 5 e Fig. Complementar 5 ). Estes resultados demonstram que o mQTL 9-2-6 é de natureza epigenética e que a variação é causada pela metilação diferencial da sequência TE localizada na região promotora do gene VTE3 (1). Até onde sabemos, este é o primeiro relatório que desvenda um QTL epigenético para uma característica nutricional altamente valiosa.

Um pequeno número de genes com epialelos naturais que levam a diferentes fenótipos foram descritos em plantas, que determinam a simetria floral em Linaria vulgaris 34 , a determinação do sexo no melão 35 ou a estatura da planta no arroz 36 . No tomate, a regulação epigenética já foi relatada para o locus cnr (incolor não amadurecido) que codifica um fator de transcrição SBP-box, que resulta no amadurecimento de frutos defeituosos. Curiosamente, foram relatados sectores de “amadurecimento” revertentes 37 , 38 . Nesse sentido, a reversão da epialela tem sido vista como um fenômeno comum em plantas 39 , 40 , 41 . Além disso, vários QTL epigenéticos para tempo de floração e comprimento de raiz foram mapeados usando uma população experimental de A. thaliana isogênica que segrega alterações induzidas na metilação do DNA 42 . Nossos resultados ampliam essas descobertas, fornecendo evidências diretas da existência de QTL epigenéticos (QTL epi ) em populações naturais.

A existência de uma segunda cópia de TE3 no tomate pode ter sido importante para o estabelecimento da variação epialélica no TE3 (1), uma vez que a regulação negativa espontânea do TE3 (1) por metilação em S. lycopersicum poderia ser compensada pela segunda cópia, evitando o fenótipo deletério da redução do tocoferol na longevidade das sementes e na resposta ao estresse 11 . Esta situação é análoga à subjacente a um caso de incompatibilidade genética em Arabidopsis 43 .

A regulação da expressão gênica dependente da epigenética associada à presença de inserções de TEs também foi descrita. Este é o caso do gene FWA em Arabidopsis cujo nível de transcrição depende do estado de metilação de um elemento SINE contido na região promotora 44 . Além disso, um estudo genômico revelou que as inserções de TE metilado estão frequentemente associadas à redução da expressão de genes adjacentes, sendo, portanto, objeto de seleção purificadora 45 . Nessa linha, a presença de uma inserção SINE TE na região promotora do gene VTE3 (1), que possibilita a existência de diversos epialelos em populações naturais de tomate, determina o acúmulo de tocoferol nos frutos ( Fig. 5a ). Além disso, a regulação epigenética dos níveis de tocoferol aqui documentada pode sugerir um papel dos epialelos que ocorrem naturalmente na adaptação ambiental hereditária. Provavelmente devido à sua natureza séssil, as plantas melhoraram extensivamente estratégias genéticas e epigenéticas para lidar com diferentes condições ambientais. O tocoferol mQTL determinado pelos epialelos nos permite estender esse fenômeno para o ajuste do potencial antioxidante que pode proporcionar vantagens de adaptação.

À luz dos resultados aqui apresentados, a baixa herdabilidade da característica do conteúdo de tocoferol 16 pode agora ser reinterpretada devido à natureza epigenética e reversível do mQTL 9-2-6 , onde a instabilidade dos epialelos produz dinâmica fenotípica que não pode ser prevista estritamente Modelos mendelianos de herança. Novos estudos visando compreender os determinantes genéticos de outras características naturais e de baixa herdabilidade permitirão o desenvolvimento de uma teoria de genética populacional que incorporará a informação epigenética e, portanto, será capaz de prever os fenótipos das plantas e suas estabilidades de maneira mais precisa.

Métodos

Materiais vegetais e condições de crescimento

Sementes de tomate de S. lycopersicum cv. M82 (LA3475), S. pennelli (LA716), IL9-2-6 (LA4083), foram obtidos do Centro de Recursos Genéticos do Tomate ( //tgrc.ucdavis.edu ). S. lycopersicum cv. MoneyMaker-GFP#6 foi obtido da ref. 19 . As sementes de Nicotiana benthamiana foram obtidas do Dr. Roger Beachy (Stanford University, CA, EUA). Plantas de tomate e N. benthamiana foram cultivadas em vasos de 20 l em condições de casa de vegetação: fotoperíodo de 16/8 h, 24±3 °C, 60% de umidade e 300±100 μmol m −2 s −1 de  fotoirradiância incidente . Folhas fonte (Sr L) e sumidouro (Sn L) foram coletadas de plantas com 8 semanas de idade. Os frutos nos estádios verde (G), MG, quebradiço (B) e maduro (R) foram colhidos 30, 45, 50 e 60 dias após a antese, respectivamente. Sementes das oito cultivares crioulas andinas, cultivares de referência comercial (GPEA, ALGR e STUF) e das duas espécies silvestres; S. pimpinellifolium (LA1589) e S. habrochaites (LA407), foram obtidos do banco de germoplasma da EEA-INTA-La Consulta (Argentina). Os dois últimos acessos foram reproduzidos a partir de sementes enviadas originalmente pelo Tomato Genetic Resource Center. As mudas foram cultivadas até quatro folhas verdadeiras em vasos de 150 ml e transplantadas para solo em condições de produção de campo no Campo Experimental del Instituto de Horticultura, Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza, Argentina, 32° 50′S, 68° 52′W e 900 msnm. O experimento de campo foi conduzido no período de outubro de 2008 a março de 2009, em delineamento inteiramente casualizado, com três repetições com três plantas cada. O experimento foi protegido com tela antigranizo e a irrigação da cultura foi aplicada para manter constante o teor de água disponível no solo. No estádio maduro, dois frutos por planta foram colhidos aproximadamente 60-65 dias após a antese e imediatamente congelados em N 2 líquido e mantidos a -80 °C até o uso.

Quantificação de tocoferol por cromatografia líquida de alta eficiência

A extração e quantificação do tocoferol foram realizadas exatamente como descrito anteriormente 9 . Resumidamente, os frutos de tomate foram moídos até um pó fino em nitrogênio líquido e 500 mg do material foram extraídos com 1,5 ml de metanol e, após mistura em vórtice, foi adicionado 1 ml de clorofórmio. Após 5 min de sonicação, foi adicionado 1 ml de tampão Tris (Tris (pH 7,5, 50 mM), NaCl 1 M). A fase de clorofórmio foi recuperada e a fase de metanol (pellet restante) foi reextraída com clorofórmio (2 ml). Os extratos de clorofórmio foram reunidos e ajustados para um volume final de 4 ml. Dois ml foram secos sob azoto gasoso e ressuspensos em 0,2 ml de hexano:isopropanol 99,5:0,5. O teor de tocoferol foi determinado utilizando um sistema HPLC Hewlett-Packard série 1100 acoplado a um detector de fluorescência (Agilent Technologies série 1200). A separação foi realizada em uma coluna de fase normal Metasil Si (250 mm × 4,6 mm, 5 μm, Varian, Metachem, Torrance, CA) mantida à temperatura ambiente usando um sistema solvente isocrático (fase móvel) consistindo de 99,5:0,5 hexano/ isopropanol com vazão de 1 ml min −1 . Os compostos eluentes foram detectados e quantificados por fluorescência com excitação a 296 nm e emissão a 340 nm. A identificação e quantificação de compostos de tocoferol foram obtidas por comparação com os tempos de retenção e áreas de pico dos padrões adquiridos da Merck (conjunto de tocoferol Calbiochem #613424). Uma curva de calibração diária foi realizada utilizando uma solução de tocoferol com faixa de concentração entre 0,31 e 5 μg ml −1 para cada isoforma.

Mapeamento fino do tocoferol QTL 9-2-6

Plantas com flores de S. lycopersicum cv. M82 e do IL9-2-6 foram cruzados. O híbrido F1 foi autofecundado e 190 plantas F2 e 50 F3 foram triadas com cinco marcadores moleculares codominantes distribuídos ao longo da introgressão: os marcadores PCR C2_At3g63190 e C2_At2g47890, e o marcador CAP C2_At4g02580 foram obtidos em //solgenomics.net . Os marcadores VTE3(1)INDEL (Chr.9: 59,6 Mb) e 1531800 (Chr.9: 61,0 Mb) foram projetados com base em InDels identificados entre as sequências do alelo VTE3 (1) de S. lycopersicum e S. pennellii e uma região flanqueadora, respectivamente . Uma planta F2 recombinante entre os marcadores C2_At4g02580 e 1531800 foi autofecundada e as linhas homozigóticas IL9-2-6-1 foram selecionadas da população F3. As sequências iniciadoras estão listadas na Tabela Suplementar 2 .

Localização subcelular VTE3 (1)

O cDNA completo de ambos os alelos de VTE3 (1) foi amplificado por PCR usando Taq Platinum Pfx DNA polimerase (Invitrogen) e clonado no vetor binário pK7FWG2 por recombinação usando clonase LR (Invitrogen) resultando em uma proteína fluorescente verde C-terminal ( GFP) proteína de fusão (pK7FWG2-VTE3(1)). As sequências iniciadoras estão listadas na Tabela Suplementar 2 . A expressão transitória via Agrobacterium tumefaciens e o exame de microscopia confocal foram realizados conforme descrito anteriormente 46 .

Silenciamento genético de TEV3 induzido por vírus (1)

Os procedimentos de construção, infiltração e colheita dos frutos foram realizados conforme descrito anteriormente 19 . Resumidamente, um fragmento de 349 pb do gene VTE3 (1) (Solyc09g065730) foi amplificado a partir de cDNA de folhas de tomate (as sequências iniciadoras estão listadas na Tabela Suplementar 2 ) e clonado no vetor pTOPO 2.1 (Invitrogen) dando origem ao pTOPO-VTE3 .1 vetor. Os vetores pTOPO- gfp 380 (ref. 19 ) e pTOPO-VTE3.1 foram digeridos com enzima de restrição EcoRI (NEB) e ligados à temperatura ambiente durante 2 h usando 0,4 unidades de T4 DNA Ligase (NEB). Os produtos de ligação foram subsequentemente amplificados por PCR e um produto de PCR de 729 pb foi inserido no vetor pCR8/GW/TOPO (Invitrogen). Os vetores resultantes foram recombinados no vetor pTRV2-GW 19 . pTRV1, pTRV2-GFP 19 e pTRV2-GFP-VTE3 (1) foram introduzidos na cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens . Uma cultura de 5 ml foi cultivada durante a noite a 28 ° C em 50 mg l -1 de gentamicina e 50 mg l -1 de canamicina em meio LB e usada para inocular 50 ml de meio LB contendo os mesmos antibióticos. Após uma cultura durante a noite a 28°C, as células foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em meio de infiltração (MgCl2 10 mM , MES 10 mM e acetosiringona 200 mM), ajustadas para uma DO600 de 1,0 e deixadas à temperatura ambiente durante 4 h. Alíquotas equivalentes de GV3101-pTRV1 e -pTRV2 foram misturadas imediatamente antes da inoculação. Pedúnculos de inflorescência pré-antese de uma semana de tomateiros com 8 semanas de idade foram feridos com uma agulha (27 G ½ polegadas) e aproximadamente 40 μl da suspensão de Agrobacterium foram entregues. Tecido de pericarpo de MG e frutos maduros foram colhidos 42 e 60 dias após a infiltração, respectivamente. Todas as amostras foram imediatamente congeladas em N 2 líquido e armazenadas a -80 °C até o uso.

Isolamento de RNA e análise qPCR

O RNA total foi extraído de 50 mg e 100 mg de folhas congeladas e pericarpos de frutos, respectivamente, com reagente TRIZOL (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os vestígios de ADN foram removidos por tratamento com DNAse I de grau de amplificação (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. O cDNA foi sintetizado a partir de 1 μg de RNA total usando primers aleatórios e a enzima SuperScript III (Invitrogen) em um volume final de 20 μl. As reações foram realizadas em duplicata utilizando o reagente 2X SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) em um volume final de 20 μl e um sistema de PCR em tempo real 7500 (Applied Biosystems). Primers utilizados para análise de expressão gênica de VTE3 (1) e as 19 ORFs selecionadas abrangendo o fragmento introgredido IL9-2-6-1 estão listados na Tabela Suplementar 2 . As sequências iniciadoras para enzimas da via biossintética de TEV que codificam genes foram como descritas anteriormente 24 e estão incluídas na Tabela Suplementar 2 .

Cromatografia gasosa-espectrometria de massa

A extração e quantificação de metabólitos foram realizadas exatamente como descrito anteriormente 19 . Resumidamente, tecidos congelados de tomate (~ 250 mg) foram extraídos com 2.000 μl de metanol e 120 μl de padrão interno (0, 2 mg ml -1 água de ribitol) foram adicionados para quantificação. A mistura foi extraída por 15 min a 70°C, misturada vigorosamente com um volume de água, centrifugada a 2.200  g e posteriormente reduzida à secura sob vácuo. O resíduo foi redissolvido e derivatizado por 120 min a 37 ° C (em 60 μl de 30 mg ml -1 de cloridrato de metoxiamina em piridina) seguido por um tratamento de 30 min a 37 ° C com 120 μl de N -metil- N -[ trimetilsilil] trifluoroacetamida. Volumes de amostra de 1 μl foram então injetados nos modos splitless e split, usando uma técnica de agulha quente. O sistema de cromatografia gasosa-tempo de voo-espectrometria de massa (GC-tof-MS) foi composto por um amostrador automático AS 2000, um cromatógrafo gasoso GC 6890N (Agilent Technologies, EUA) e um tempo de voo de massa Pegasus III. espectrômetro (LECO Instruments, EUA). Os espectros de massa foram registrados em 20 varreduras s −1 com uma faixa de varredura de 70 a 600 m/z. Tanto os cromatogramas quanto os espectros de massa foram avaliados utilizando o software de processamento de cromatografia ChromaTOF e deconvolução espectral de massa, versão 3.00 (LECO Instruments, EUA). A identificação e quantificação dos compostos foram realizadas com o software TagFinder 4.0 47 e os espectros de massa foram referenciados com aqueles do banco de dados Golm Metabolome 48 , 49 . Seis réplicas biológicas foram utilizadas para esta análise.

Análises de sequência promotora

A identificação in silico do CRE foi realizada conforme indicado 24 . Os TEs foram identificados pelo WU-BLAST (versão v4.0.3) com RepeatMasker 50 no banco de dados Solanacea.

Ensaio de metilação baseado em McrBC

O DNA genômico foi extraído de 100 mg de frutos de tomate pelo kit PhytoPure (GE Healthcare). Uma quantidade de 1 μg de DNA foi digerida por 3 h com 10 U de enzima McrBC (NEB) em paralelo com uma reação simulada. 50 ng de DNA digerido foram ainda utilizados para 28 ciclos de amplificações por PCR em tampão de reação 1X com MgCl2 0,75 mM, dNTPs 0,1 μM, concentração de iniciador 0,4 μM e 1 unidade de DNA polimerase Platinum TAQ (Invitrogen). As condições de ciclagem foram: 15 s 94 °C, 1 min 55 °C e 1 min 72 °C. As sequências iniciadoras estão listadas na Tabela Suplementar 2 .

Análise de bissulfito

O tratamento com bissulfito foi realizado em 200 ng de DNA genômico usando o kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Reseacrh). O DNA tratado foi amplificado por nested PCR utilizando os primers listados na Tabela Suplementar 2 . Os fragmentos amplificados foram clonados no vetor pGEM-T (Promega) para sequenciamento. Pelo menos nove clones de cada genótipo foram sequenciados. A eficiência de conversão do bissulfito foi calculada analisando um loci de cloroplasto 51 indicando uma taxa de conversão superior a 99%.

análise de siRNA

Pequenos RNAs de frutos maduros foram extraídos utilizando o kit mirVana (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Bibliotecas de RNA foram multiplexadas e sequenciadas em um sistema HiSeq2500 (Illumina), obtendo ~12 milhões de leituras de alta qualidade por biblioteca. Após o recorte com fastx_clipper (FASTX-Toolkit), as leituras foram mapeadas sem incompatibilidades com as sequências de referência dos loci S. lycopersicum e S. pennellii VTE3 (1) usando o software bowtie2 52 . A visualização do mapeamento foi realizada utilizando o Integrative Genomics Viewer (IGV) 53 . Informações sobre pequenas sequências de RNA são fornecidas na Tabela Suplementar 3 .

Ensaio de atividade do promotor VTE3(1)

Uma região promotora de aproximadamente 1.000 pb dos dois alelos VTE3 (1) foi clonada no MCS a montante da luciferase do vaga-lume (LUC) no vetor pGreenII 0800-LUC contendo o gene da luciferase Renilla (REN) sob o controle do 35S promotor 54 , transformado em células de Agrobacterium tumefaciens (cepa GV3101) e infiltrado em folhas totalmente expandidas de plantas adultas de Nicotiana benthamiana . Após 2 dias, as folhas foram colhidas e medidas quanto às atividades de LUC e REN utilizando o Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega).